C2238 / αanp modula la apolipoproteína e a través de egr-1 / mir199a en células vasculares del músculo liso in vitro | muerte celular y enfermedad

C2238 / αanp modula la apolipoproteína e a través de egr-1 / mir199a en células vasculares del músculo liso in vitro | muerte celular y enfermedad

Anonim

Asignaturas

  • Aterosclerosis
  • Señalización celular
  • La expresion genica
  • Lipoproteínas

Resumen

Los sujetos que portan la variante del gen T2238C ANP tienen un mayor riesgo de sufrir un derrame cerebral o infarto de miocardio. Los mecanismos a través de los cuales T2238C / α ANP ejerce efectos vasculares perjudiciales deben aclararse por completo. En el presente trabajo, nuestro objetivo fue explorar el impacto de C2238 / α ANP (forma mutante) en las vías relacionadas con la aterosclerosis. Como primer paso, se realizó un análisis de macroarrays de expresión génica de aterosclerosis en células de músculo liso vascular (VSMC) expuestas a ANP T2238 / α (tipo salvaje) o ANP C2238 / α . El principal hallazgo fue que la expresión del gen de la apolipoproteína E ( ApoE ) se redujo significativamente por C2238 / α ANP y se incrementó por T2238 / α ANP. Posteriormente, encontramos que el ANP C2238 / α induce la regulación negativa de ApoE a través de mecanismos dependientes del receptor de péptido natriurético tipo C (NPR-C) que implican la regulación positiva de miR199a-3p y miR199a-5p y la regulación negativa de DNAJA4. De hecho, la caída de NPR-C rescató el nivel de ApoE. La regulación de miR199a por NPR-C estuvo mediada por un aumento reactivo dependiente de la especie de oxígeno del factor de transcripción de la proteína de respuesta temprana al crecimiento (Egr-1). De hecho, la eliminación de Egr-1 abolió el impacto de C2238 / α ANP en ApoE y miR199a. Es de destacar que la regulación a la baja de ApoE por C2238 / α ANP se asoció con un aumento significativo en la inflamación, apoptosis y necrosis que fue completamente rescatada por la administración exógena de ApoE recombinante. En conclusión, nuestro estudio diseccionó un nuevo mecanismo de daño vascular ejercido por el ANP C2238 / α que está mediado por la regulación negativa de ApoE. Proporcionamos la primera demostración de que C2238 / α ANP regula negativamente ApoE en VSMC a través de la activación dependiente de NPR-C de Egr-1 y la consiguiente regulación positiva de miR199a. Restaurar los niveles de ApoE podría representar una estrategia terapéutica potencial para contrarrestar los efectos nocivos del C2238 / α ANP.

Principal

El péptido natriurético auricular (PNA) desempeña importantes funciones cardiovasculares citoprotectoras, como los efectos antihipertróficos, antiproliferativos y de supervivencia en los cardiomiocitos, las células del músculo liso vascular (CMVV), los fibroblastos y las células endoteliales. 1 Un trabajo reciente demostró que una variante molecular de α ANP (C2238 / α ANP), que se caracteriza por la extensión C-terminal del péptido con dos residuos de arginina y es secundaria a la sustitución de una timina por una citosina en la posición 2238 de El gen ANP ejerce efectos vasculares perjudiciales. De hecho, nosotros y otros grupos mostramos previamente que los sujetos que portan la variante del gen ANP T2238C tienen un riesgo significativamente mayor de sufrir un derrame cerebral o un infarto de miocardio y muestran un aumento significativo de marcadores circulantes de activación de leucocitos. 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 En general, esta evidencia destaca la necesidad de encontrar objetivos terapéuticos para prevenir o reducir los efectos perjudiciales de la variante del gen C2238 / α ANP, que es relativamente frecuente en la población general. Sin embargo, esto es posible solo si los mecanismos moleculares a través de los cuales el ANP C2238 / α favorece el desarrollo de la disfunción vascular, la aterosclerosis y los accidentes cardiovasculares se aclaran por completo.

Anteriormente informamos que la variante molecular C2238 / α ANP promueve la apoptosis celular, la necrosis y el estrés oxidativo, mientras que reduce la proliferación celular, la angiogénesis y la vasodilatación. 9, 10, 11 Mecánicamente, encontramos que los efectos nocivos de la variante C2238 / α ANP están mediados por una activación desregulada del receptor de péptido natriurético tipo C (NPR-C) con una disminución consiguiente de los niveles de AMPc y la actividad PKA. 10, 11 La activación anormal de NPR-C se asoció con una reducción de la vía Akt / eNOS y un aumento de la actividad de especies reactivas de oxígeno (ROS) derivadas de NADPH oxidasa en las células endoteliales. 9, 10 Además, un fenómeno epigenético que involucra a miR21 contribuyó significativamente a los efectos perjudiciales de C2238C / α ANP en la viabilidad y función celular en VSMC. 11 Sin embargo, estos mecanismos moleculares solo pueden explicar las propiedades nocivas de C2238 / α ANP en la estabilidad de la placa aterosclerótica. Por otro lado, la interacción de C2238 / α ANP con múltiples genes / proteínas directamente relacionados con el proceso aterosclerótico sigue siendo desconocida. Esta última posibilidad está respaldada por la participación conocida de péptidos natriuréticos en la aterosclerosis. 1

Por esta razón, realizamos un análisis de macroarrays de expresión génica en VSMC, un elemento celular clave en el desarrollo de la aterosclerosis 12 y un objetivo de ANP, 1 con el fin de investigar el impacto potencial de T2238C / α ANP en los mecanismos subyacentes a la aterosclerosis. Descubrimos que C2238 / α ANP induce una regulación negativa significativa de la expresión del gen de la apolipoproteína E ( ApoE ), que codifica una proteína antiaterosclerótica y antiinflamatoria conocida, a través de la activación de la vía de señalización NPR-C / Egr-1 / miR199a / DNAJA4 que diseccionamos aquí por primera vez. Se descubrió que la regulación por disminución de ApoE es responsable de las anormalidades celulares perjudiciales inducidas por T2238C / α ANP en VSMC.

Resultados

Expresión diferencial del gen ApoE en VSMC inducidas por TT2238 / α ANP y CC2238 / α ANP

El perfil de expresión de los genes de aterosclerosis de las células del músculo liso de la vena umbilical humana (HUVSMC) expuestas a TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP, en comparación con las células no estimuladas, se informa en la Tabla 1. Entre las secuencias que estaban reguladas de manera significativa y diferencial (al menos 5 veces) por las dos formas de α ANP, el gen ApoE se redujo significativamente por CC2238 / α ANP, mientras que TT2238 / α ANP lo estimuló notablemente. Validamos los resultados del macroarray demostrando que tanto los niveles de expresión de ARNm como de ApoE estaban regulados negativamente tanto en HUVSMCs (Figuras 1a yb) como en SMC de arterias coronarias (CAMSCs) (Figuras 1c yd) por CC2238 / α ANP, mientras que estaban regulados por TT2238 / α ANP. Como es bien sabido que ApoE ejerce acciones antiateroscleróticas y antiinflamatorias críticas, 13 decidimos evaluar si la regulación por disminución de ApoE media los efectos perjudiciales de CC2238 / α ANP.

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Regulación diferencial de los niveles de ARNm y proteínas de ApoE por TT2238 / α ANP y CC2238 / α ANP en HUVSMCs y CAMSCs. Resultados de la RT-PCR ( ayc ) y de la transferencia Western ( byd, con el análisis densitométrico correspondiente) para los niveles de expresión de ApoE en HUVSMC (parte superior) y en CASMC (parte inferior). Los resultados se expresan como media ± DE Número de experimentos independientes = 6. Δ P <0.005 para TT2238 / α ANP versus CTR. ** P <0.0001 para TT2238 / α ANP versus CC2238 / α ANP ( ayb ) y para CC2238 / α ANP versus CTR y TT2238 / α ANP ( byd ). CC2238 / α ANP, variante α ANP; TT2238 / α ANP, α ANP de tipo salvaje; CTR, control

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CC2238 / α ANP induce la regulación negativa de ApoE a través de mecanismos dependientes de NPR-C asociados con la regulación positiva de miR199a

Luego diseccionamos los mecanismos a través de los cuales CC2238 / α ANP induce la reducción de la expresión de ApoE. El trabajo previo de nuestro laboratorio demostró que CC2238 / α ANP induce efectos vasculares perjudiciales a través de una activación desregulada de NPR-C. 10, 11 Por lo tanto, investigamos si NPR-C media los efectos de CC2238 / α ANP en los niveles de expresión de ApoE. Nuestros resultados confirmaron esta hipótesis, ya que descubrimos que la eliminación de NPR-C rescató los niveles de expresión de ApoE tanto en HUVSMC como en células de músculo liso de la arteria coronaria (CASMC) expuestas a CC2238 / α ANP (Figuras 2a y 3a).

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El ANP C2238 / α induce la regulación negativa de ApoE a través de mecanismos dependientes de NPR-C asociados con la regulación positiva de miR199a y de Egr-1 en HUVSMCs. ( a ) Análisis por RT-PCR y por transferencia Western de los niveles de expresión de ApoE sobre CC2238 / α ANP en células NPR-C no silenciadas y silenciadas. ** P <0.0001 para CC2238 / α ANP versus todas las otras muestras. ( b ) niveles de ARNm de miR199a-3p, miR199a-5p, DNAJA4 en TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP (parte superior del panel) y en NPR-C células no silenciadas y silenciadas en CC2238 / α ANP (parte inferior del panel). Se usaron dos siRNA específicos para obtener el silenciamiento del gen NPR-C. ** P <0.0001 para CC2238 / α ANP versus TT2238 / α ANP y CTR. Δ P <0.005 para TT2238 / α ANP versus CTR y para CC2238 / α ANP versus CTR (miR199a-3p y miR199a-5p). ( c ) Transferencia Western representativa de Egr-1, con análisis densitométrico correspondiente bajo exposición TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP (lado izquierdo) y bajo CC2238 / α ANP en células NPR-C no silenciadas y silenciadas (lado derecho) . ** P <0.0001 para CC2238 / α ANP versus todas las otras muestras. Los resultados se expresan como media ± DE Número de experimentos independientes = 6. CC2238 / α ANP, variante α ANP; TT2238 / α ANP, α ANP de tipo salvaje; siRNA1, silenciador génico NPR-C 1; siRNA2, silenciador génico NPR-C 2; hsa-miR199a, microARN199a humano; Egr-1, respuesta de crecimiento temprano proteína-1; CTR, control

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El ANP C2238 / α induce la regulación negativa de ApoE a través de mecanismos dependientes de NPR-C asociados con la regulación positiva de miR199a y de Egr-1 en CASMC. ( a ) Análisis por RT-PCR y por transferencia Western de los niveles de expresión de ApoE sobre CC2238 / α ANP en células NPR-C no silenciadas y silenciadas. ** P <0.0001 para CC2238 / α ANP versus todas las otras muestras. ( b ) niveles de ARNm de miR199a-3p, miR199a-5p, DNAJA4 en TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP (parte superior del panel) y en NPR-C células no silenciadas y silenciadas en CC2238 / α ANP (parte inferior del panel). Se usaron dos siRNA específicos para obtener el silenciamiento del gen NPR-C. ** P <0.0001 para CC2238 / α ANP versus TT2238 / α ANP y CTR. Δ P <0.005 para TT2238 / α ANP versus CTR y para CC2238 / α ANP versus CTR (miR199a-3p y miR199a-5p). ( c ) Transferencia Western representativa de Egr-1, con análisis densitométrico correspondiente bajo exposición TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP (lado izquierdo) y bajo CC2238 / α ANP en células NPR-C no silenciadas y silenciadas (lado derecho) . ** P <0.0001 para CC2238 / α ANP versus todas las otras muestras. Los resultados se expresan como media ± DE Número de experimentos independientes = 6. Para abreviaturas ver Figura 2

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Cabe destacar que la evidencia previa demostró que los niveles de expresión de ApoE están regulados epigenéticamente por miR199a-3p y miR199a-5p, que a su vez pueden dirigirse directamente a ApoE o a la proteína de choque térmico DNAJA4, que promueve la regulación positiva de ApoE. 14 En línea con esta evidencia, encontramos que los niveles de expresión miR199a-3p y miR199a-5p están significativamente regulados por CC2238 / α ANP, mientras que TT2238 / α ANP los regula negativamente. Por otro lado, el nivel de expresión de DNAJA4 resultó estar regulado negativamente por CC2238 / α ANP, mientras que no se modificó en las células expuestas a TT2238 / α ANP (Figuras 2b y 3b). Curiosamente, observamos que la eliminación de NPR-C rescató los niveles de expresión de miR199a-3p, miR199a-5p y DNAJA4 en ambas líneas VSMC tratadas con ANC CC2238 / α (Figuras 2b y 3b). Estos datos sugieren que NPR-C regula los niveles de ApoE a través de la regulación de miR199a-3p, miR199a-5p y DNAJA4.

NPR-C regula miR199a a través de la activación dependiente de ROS de la proteína de respuesta temprana al crecimiento 1 (Egr-1)

Luego, tratamos de dilucidar los mecanismos de señalización a través de los cuales NPR-C promueve la regulación positiva de miR199a-3p y miR199a-5p, la regulación negativa de DNAJA4 y, en última instancia, la regulación negativa de los niveles de expresión de ApoE en respuesta a CC2238 / α ANP. El factor de transcripción Egr-1 se encontró previamente para promover la regulación positiva de miR199a. 15 Además, Egr-1 a menudo se encuentra activado en la vasculatura durante el estrés y se describió que está involucrado en el proceso aterosclerótico. 16 Por lo tanto, evaluamos si Egr-1 está involucrado en la regulación dependiente de NPR-C de miR199a-3p y miR199a-5p en respuesta a CC2238 / α ANP. Descubrimos que Egr-1 está sobrerregulado en respuesta a CC2238 / α ANP y este efecto fue derogado por la eliminación de NPR-C (Figuras 2c y 3c). Se sabe que CC2238 / α ANP induce la activación de NADPH oxidasa dependiente de NPR-C y la producción de ROS. 9, 10 Egr-1 puede ser activado por ROS. 17 De acuerdo con esto, encontramos que la regulación al alza dependiente de ANP C2238 / α de Egr-1 fue amortiguada por apocynin, un inhibidor de la NADPH oxidasa (Figura complementaria S1). Finalmente, encontramos que la eliminación de Egr-1 normalizó los niveles de miR199a y DNAJA4 y bloqueó la regulación negativa de ApoE en ambas líneas de VSMC tratadas con CC2238 / α ANP (Figura 4). En general, estos datos indican que CC2238 / α ANP conduce a la regulación positiva de miR199a y a la regulación negativa de ApoE en VSMC a través de la producción de ROS dependiente de NPR-C que a su vez conduce a la activación de Egr-1.

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Impacto del silenciamiento del gen Egr-1 en la vía reguladora de ApoE tanto en HUVSMC como en CAMSC. ( a ) Impacto del silenciamiento del gen Egr-1 en los niveles de expresión de Egr-1, miR199-3p, miR199-5p, DNAJA4 (detectado por RT-PCR) y en los niveles de expresión de ApoE (detectado tanto por RT-PCR como por Western blotting ) en HUVSMCs. Se usaron dos siRNA específicos para obtener la disrupción del gen Egr-1. ( b ) Impacto del silenciamiento del gen Egr-1 en los niveles de expresión de Egr-1, miR199-3p, miR199-5p, DNAJA4 (detectado por RT-PCR) y en los niveles de expresión de ApoE (detectados por RT-PCR y western blot) en CASMCs. Los resultados se expresan como media ± DE Número de experimentos independientes = 4 para cada línea celular. ** P <0.0001 para CC2238 / α ANP versus todos los demás puntos. siRNA1, silenciador génico Egr-1 1; siRNA2, silenciador génico Egr-1 2; para otras abreviaturas ver Figuras 2 y 3

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CC2238 / α ANP modula la apoptosis, la necrosis y la inflamación en VSMC a través de la regulación negativa de ApoE dependiente de NPR-C

Luego, evaluamos la importancia biológica de la regulación por disminución de ApoE en células expuestas a CC2238 / α ANP. Las figuras suplementarias S2 y S3 muestran los resultados del análisis de transferencia Western para evaluar los niveles de expresión de caspasa-3 escindida, represor celular del gen estimulado por E1A (CREG) y formas fosforiladas y totales de JNK y p38MAPK en HUVSMCs (Figura complementaria S2 ) y en CASMC (Figura complementaria S3) en presencia de CC2238 / α ANP. La caspasa-3 escindida se incrementó en CC2238 / α ANP (Figuras suplementarias S2A y S3A). Por otro lado, la expresión de CREG, un factor antiapoptótico, se redujo (Figuras complementarias S2B y S3B). De manera consistente con estudios previos que muestran que CREG inhibe la apoptosis de VSMC a través de la inhibición de las vías de señalización de p38MAPK y JNK, 18 observamos un aumento paralelo de la fosforilación de p38MAPK y JNK en ambos HUVSMC y CASMC tratados con CC2238 / α ANP en comparación con las células de control (Suplementario Figuras S2C, D, S3C y D). Es de destacar que la caída de NPR-C rescató por completo los efectos de CC2238 / α ANP sobre la caspasa-3 escindida, fosfo-p38MAPK, fosfoJNK y CREG. Los niveles celulares de NF- κ B y Smad4, marcadores conocidos de inflamación, también aumentaron significativamente tanto en HUVSMC como en CASMC expuestos a CC2238 / α ANP (Figuras complementarias S2E, F, S3E y F). El silenciamiento del gen NPR-C redujo el aumento de NF- κ B y Smad4 a pesar de la presencia de CC2238 / α ANP en ambas líneas VSMC (Figuras suplementarias S2E, F, S3E y F). En conjunto, estos hallazgos indican que C2238 / α ANP induce apoptosis e inflamación en VSMC a través de mecanismos dependientes de NPR-C.

Es de destacar que encontramos que estos mecanismos están mediados por la regulación negativa de ApoE. En primer lugar, el análisis de secuenciación reveló que los HUVSMC expresan las isoformas 2 y 3 de ApoE (APOE2 / APOE3) mientras que los CASMC expresan las isoformas 3 y 4 de ApoE (APOE3 / APOE4) (Figura 4 complementaria). Más importante aún, encontramos que la restauración de los niveles de ApoE tanto en HUVSMC (Figura 5a) como en CASMC (Figura 5b) tratados con CC2238 / α ANP a través de la administración exógena concomitante de la isoforma recombinante ApoE correspondiente fue capaz de rescatar la viabilidad celular, lo que fue significativamente deteriorado por CC2238 / α ANP solo en comparación con las células no tratadas. La administración de ApoE redujo significativamente la apoptosis temprana y tardía y la necrosis inducida por CC2238 / α ANP. Además, los VSMC mostraron una disminución significativa de la inflamación bajo exposición a ApoE recombinante a pesar de la presencia de CC2238 / α ANP (Figura 6).

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Efecto de ApoE recombinante sobre la viabilidad celular en presencia de CC2238 / α ANP tanto en HUVSMCs ( a ) como en CASMCs ( b ) Las células se expusieron concomitantemente a ApoE recombinante y CC2238 / α ANP. Al final de la estimulación, FACS analizó la viabilidad celular. Cada panel de figuras muestra gráficos de dispersión representativos para cada condición experimental (lado izquierdo) y el análisis densitométrico correspondiente (lado derecho). Los resultados se expresan como media ± DE Número de experimentos independientes = 3 para cada isoforma ApoE. ** P <0.0001 para CC2238 / α ANP versus todos los demás puntos. CC2238 / α ANP, variante α ANP; CTR, control; PI, yoduro de propidio; ApoE, apolipoproteína E; CTR, control

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Efecto de la ApoE recombinante sobre los marcadores de inflamación en presencia de CC2238 / α ANP tanto en HUVSMC ( a ) como en CASMC ( b ). Las células se expusieron concomitantemente a ApoE recombinante y ANP CC2238 / α . Veinticuatro horas después de la finalización de la estimulación, las proteínas totales se analizaron en busca de marcadores de inflamación por Western Blot. ( a ) Transferencia western representativa de Nf- κ B y Smad4, con el análisis densitométrico correspondiente, en HUVSMCs. ( b ) Western blot representativo de Nf- κ B y Smad4, con el análisis densitométrico correspondiente, en CASMC. Los datos se expresan como media ± DE Número de experimentos independientes = 3 para cada isoforma ApoE. ** P <0.0001 para CC2238 / α ANP versus todos los demás puntos. CC2238 / α ANP, variante α ANP; ApoE, apolipoproteína E; CTR, control

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Discusión

La variante del gen T2238C / α ANP es un factor de riesgo cardiovascular no modificable emergente. De hecho, los sujetos que portan esta variante genética tienen un mayor riesgo de aparición de eventos adversos cardiovasculares, como accidente cerebrovascular e infarto de miocardio. Además, estos sujetos muestran signos de disfunción endotelial ya a una edad temprana. Aquí, analizamos el impacto de la variante del gen T2238C / α ANP en los mecanismos relacionados con la aterosclerosis. Encontramos que C2238 / α ANP regula significativamente la expresión del gen ApoE en VSMC a través de mecanismos dependientes de NPR-C. También demostramos que el ANP C2238 / α juega este efecto a través de una regulación epigenética selectiva de ApoE que involucra Egr-1 y dos pequeños ARN no codificantes (miR199a-3p y miR199a-5p). Lo que es más importante, proporcionamos evidencia de que los efectos perjudiciales inducidos por el eje C2238 / α ANP – NPR-C en los VSMC, como el aumento de la tasa de apoptosis, necrosis e inflamación, podrían recuperarse completamente mediante la suplementación de la proteína ApoE recombinante (Figura 7).

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Representación esquemática de la vía que implica NPR-C, Egr-1, miR199a-3p y miR199a-5p en la modulación ApoE tras la exposición CC2238 / α ANP en VSMCs. Los efectos positivos de la administración de suplementos de ApoE a los VSMC, a pesar de la exposición CC2238 / α ANP, respaldan la fuerte contribución de esta vía en la promoción del daño vascular a través de la regulación negativa de ApoE final. C2238 / α ANP, variante α ANP; NPR-C, receptor de péptido natriurético tipo C; ROS, especies reactivas de oxígeno; Egr-1, respuesta de crecimiento temprano proteína-1; miR199a, microRNA199a; CREG, represor celular del gen estimulado por E1A; JNK, c-jun quinasa N-terminal

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Estos datos extienden significativamente nuestra evidencia previa que demuestra que C2238 / α ANP induce la muerte de las células endoteliales y el estrés oxidativo, reduce la angiogénesis y promueve la disfunción endotelial a través de la activación desregulada de la señalización NPR-C / cAMP y la reducción de la vía PKA / Akt / eNOS. 9, 10 Además, recientemente encontramos que el ANP C2238 / α aumenta el estrés oxidativo y la migración celular y promueve la vasoconstricción a través de la vía de señalización NPR-C / cAMP / PKA / CREB / miR21. 11 El estudio actual demuestra por primera vez un impacto directo de C2238 / α ANP en los mecanismos subyacentes a la aterosclerosis en VSMC, un elemento clave en este proceso. De hecho, C2238 / α ANP induce una regulación negativa significativa de ApoE que juega un papel importante en el desarrollo de la aterosclerosis. 19, 20 ApoE es una proteína de 34 kDa que participa en la movilización y distribución del colesterol y de otros lípidos entre varios tejidos del cuerpo. 20 Se sabe que la deficiencia de ApoE por sí sola promueve el desarrollo de placas ateroescleróticas aórticas en ratones. 21 Estudios previos demostraron que ApoE también ejerce efectos celulares antiateroscleróticos y antiinflamatorios pleiotrópicos. Anteriormente se descubrió que ApoE se expresaba en VSMC donde la regulación negativa de ApoE se correlaciona positivamente con marcadores típicos de inflamación tales como Smad4 22 y NF- κ B. 23 Además, ApoE obstaculiza las funciones proinflamatorias de las células inflamatorias. 24 En humanos, donde la falta de ApoE es rara, el riesgo de aterosclerosis está fuertemente asociado con tres isoformas de apoE comunes en el orden de APOE4> APOE3> APOE2. 20 Además, se sabe que ApoE desempeña un papel en el desarrollo de enfermedades cardiovasculares y neurológicas. 26 Por lo tanto, nuestro estudio puede sugerir que C2238 / α ANP induce anormalidades celulares a través de la inhibición de los efectos pleiotrópicos descritos anteriormente de ApoE. Además, dado que se informaron niveles más altos de mieloperoxidasa en ratones Apo - / - 27, podemos postular que el ANP C2238 / α puede, al menos en parte, asociarse a niveles más altos de mieloperoxidasa, como se informó anteriormente en pacientes con enfermedad coronaria, 4 a través de su capacidad para disminuir la expresión del gen ApoE.

Por otro lado, nuestros resultados actuales indican que el α ANP de tipo salvaje puede ejercer efectos antiateroscleróticos fisiológicos al regular los niveles de ApoE. Esta posibilidad está respaldada por evidencia previa que sugiere una estrecha relación entre los péptidos natriuréticos (NP) y la aterosclerosis. De hecho, los NP se expresan significativamente más en explantes coronarios humanos de lesiones ateroscleróticas avanzadas. 28 La inhibición de la degradación de NP por el inhibidor de NEP candoxatril evitó el depósito de grasa en un modelo de conejo. 29 Los niveles circulantes de NP aumentan en paralelo al aumento de la estenosis de la placa coronaria, alcanzando un nivel de meseta en el grado más alto de estenosis de los vasos. 30

En particular, el trabajo anterior ha demostrado que la aterosclerosis aumenta en un modelo animal que carece de NPR-A y ApoE (Npr1 - / - ApoE - / - ratones) 31, lo que sugiere que la falta de NPR-A podría inducir el crecimiento de VSMC a través de la señalización de otros receptores, por lo tanto potenciando los efectos vasculares negativos debido a la falta de ApoE.

Otro hallazgo original de nuestro estudio es la demostración de que C2238 / α ANP induce la regulación negativa de ApoE a través de la regulación positiva dependiente de NPR-C de Egr-1. Este efecto está mediado por la actividad de la NADPH oxidasa, ya que la apocynina anuló los efectos de C2238 / α ANP en la activación de Egr-1. Hasta donde sabemos, esta es la primera vez que se demuestra una regulación epigenética negativa de ApoE por Egr-1 en el contexto vascular. Este hallazgo también amplía la evidencia previa que aboga por un papel de la activación de Egr-1 en el desarrollo de la aterosclerosis y puede sugerir que la activación de Egr-1 puede contribuir a la aterosclerosis a través de la regulación negativa de ApoE. Curiosamente, el trabajo previo demostró que la aterosclerosis se reduce en un modelo de doble eliminación de ratones Egr-1 y ApoE, en comparación con lo observado en el modelo de eliminación de ApoE - / - solamente, lo que sugiere que la falta de Egr-1 es protectora en ausencia de ApoE. 32 Nuestro estudio amplía esta evidencia al demostrar que Egr-1 puede estar corriente arriba de ApoE, regulando negativamente su expresión.

Es de destacar que encontramos que la activación de Egr-1 por C2238 / α ANP promueve la regulación positiva de miR199a-3p y miR199a-5p, lo que confirma los hallazgos anteriores que demuestran que Egr-1 regula miR199a. 15 Estos datos sugieren que Egr-1 puede regular epigenéticamente ApoE a través de estos dos microARN (miARN). De hecho, Pencheva et al. 14 han demostrado recientemente que miR199a-3p y miR199a-5p regulan la formación de metástasis de melanoma a través de la regulación negativa de los niveles de ApoE. Los autores descubrieron que estos miARN pueden atacar a ApoE directa o indirectamente inhibir los niveles de ApoE a través de DNAJA4, una proteína de choque térmico que estimula los niveles de ApoE. En línea con esta evidencia, también encontramos que la señalización C2238 / α ANP / NPR-C / Egr-1 / miR199a promueve la regulación a la baja de los niveles de DNAJA4.

Cabe destacar que estos hallazgos refuerzan la evidencia disponible que aclara el papel de los miRNA en la patogénesis de las anomalías de VSMC y de las enfermedades vasculares en general. En este sentido, encontramos previamente que una desregulación de miR21 contribuyó a los trastornos VSMC tras la estimulación de ANP C2238 / α . 11 Además, recientemente se encontró que la regulación negativa de miR23b en la pared vascular lesionada modula el cambio fenotípico de VSMC a través de la participación de SMAD3 y FOXO4. 33 En general, esta evidencia respalda el conocimiento de que los mecanismos epigenéticos dependientes de miRNA pueden regular la patogénesis de enfermedades humanas de una manera altamente integradora.

Entregas previas de ApoE3 humano mediante inyección intramuscular de plásmidos y adenovirus, 34 por péptidos miméticos de apolipoproteína sintética 35 o por una plataforma basada en células, 36 han inhibido el desarrollo de lesiones ateroscleróticas. Primero evaluamos la isoforma específica de ApoE expresada por las dos líneas VSMC utilizadas en nuestros estudios, que nunca se informó antes. En consecuencia, observamos todos los beneficios de la exposición de VSMC a la isoforma ApoE recombinante específica, a pesar de la presencia de ANP C2238 / α . Los efectos pleiotrópicos de ApoE pueden explicar nuestros resultados, ya que esta proteína es ateroprotectora no solo por su efecto hipolipemiante sino también por sus actividades antioxidantes y antiinflamatorias. 19 Los resultados beneficiosos obtenidos a través del tratamiento con ApoE de VSMC dañados expuestos a ANP C2238 / α resaltan el papel clave potencial de esta molécula en el tratamiento de la aterosclerosis en sujetos con la variante ANP C2238 / α , aunque todavía existen varias limitaciones para su aplicación clínica.

En resumen, informamos la primera evidencia de un nuevo mecanismo de enfermedad vascular en VSMC mediada por NPR-C, que involucra Egr-1 y dos pequeños ARN no codificantes dependientes, que finalmente conducen a la regulación negativa de ApoE, en presencia de la variante del gen C2238 / α ANP, un factor de riesgo cardiovascular emergente. Esta cascada de transducción recientemente descubierta contribuye a la amplia gama de acciones vasculares dañinas debido a C2238 / α ANP que contrastan con las propiedades beneficiosas conocidas de α ANP de tipo salvaje. Además, nuestros nuevos hallazgos descubren acciones pleiotrópicas desconocidas de NPR-C en las células vasculares a través de su participación en la regulación epigenética de las proteínas antiateroscleróticas vasculares, como la apolipoproteína E.

Materiales y métodos

Estimulación de HUVSMC con TT2238 y CC2238 / α ANP y extracción de ARN para el análisis de macroarrays de aterosclerosis

Los HUVSMC disponibles comercialmente se estimularon con ANP natural sintético (TT2238) o ANP mutante (CC2238) / α a una concentración final de 10 9 mol / l durante 12 h, como se describió previamente. 9, 10, 11 placas de control recibieron medio libre de α ANP. Se realizaron tres experimentos. El ARN total, obtenido al final de la estimulación, se usó para la síntesis de ADNc y luego para el análisis de macroarrays. La confirmación de la modulación del gen ApoE y la proteína en CC2238 / α ANP y TT2238 / α ANP se obtuvo posteriormente en experimentos independientes en HUVSMC y también en CASMC (número de experimentos = 6 para cada línea celular) por RT-PCR, basado en la metodología SYBR Green, y por transferencia Western de proteínas totales.

Impacto del silenciamiento del gen NPR-C en la modulación del gen ApoE y la proteína sobre CC2238 / α ANP

La estimulación de HUVSMC y CASMC con CC2238 / α ANP se repitió tanto en presencia como en ausencia de NPR-C (número de experimentos = 6) para verificar el papel de este receptor en la mediación de los efectos de CC2238 / α ANP en el gen ApoE y niveles de expresión de proteínas, de acuerdo con nuestros informes anteriores. 10, 11

Papel de la activación dependiente de NPR-C de miRNA199a-3p y miRNA199a-5p en la modulación de ApoE por CC2238 / α ANP. Implicación de Egr-1

Para verificar si una modulación epigenética conocida de ApoE, dependiente de miRNA199a-3p y 199a-5p, 14 desempeñaba un papel en nuestro contexto experimental, el ARN total, extraído tanto de NPR-C no silenciado como de HUVSMC y CASMC silenciados, se purificó para aislar ARN pequeños mediante el uso de un kit comercialmente disponible. Para la RT-PCR de DNAJA4, un objetivo conocido de miRNA199a, 14 se usó un ensayo de expresión génica TaqMan. Luego, con base en el conocimiento previo de que los niveles de expresión de miRNA199a están modulados por Egr-1, 15 evaluamos el nivel de expresión de la proteína Egr-1 en TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP mediante transferencia Western. También establecimos mejor el papel de Egr-1 en la modulación ApoE bajo CC2238 / α ANP con experimentos adicionales. Primero, el papel conocido del estrés oxidativo en la estimulación Egr-1 17 se verificó exponiendo VSMCs a CC2238 / α ANP tanto en ausencia como en presencia de apocinina (número de experimentos = 3), siguiendo las condiciones descritas previamente. Por lo tanto, los niveles de expresión de Egr-1 se evaluaron mediante transferencia Western. Posteriormente, se determinó la modulación de miRNA199a-3p y miRNA199a-5p, de DNAJA4 y de ApoE en VSMC silenciados con Egr-1 expuestos a CC2238 / α ANP (número de experimentos = 4).

Evaluación de los niveles de expresión de caspasa-3, CREG, JNK, p38MAPK, Nf- k Bp65 y TGF β (Smad4) escindidos como marcadores de apoptosis, necrosis e inflamación en CC2238 / α ANP tanto en presencia como en ausencia de NPR-C

Para verificar si la regulación a la baja de la expresión de ApoE en nuestras condiciones experimentales se asoció, como se esperaba, con una mayor tasa de apoptosis, necrosis e inflamación, se analizaron 13 proteínas totales mediante el uso de los siguientes anticuerpos primarios específicos: caspasa-3 anti-escindida, anti-CREG, anti-phosphoJNK, anti-JNK, anti-phospho-p38MAPK, anti-p38MAPK, anti-NF κ Bp65, anti-Smad4, anti- β- actina. Este último se usó como la proteína de limpieza. Después de la incubación con anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante, las señales se revelaron como se describe a continuación.

Impacto de la exposición a ApoE recombinante en la viabilidad celular, apoptosis, necrosis e inflamación tanto en HUVSMC como en CASMC en presencia de CC2238 / α ANP

Para probar la capacidad de la suplementación con ApoE para rescatar los efectos nocivos inducidos por CC2238 / α ANP, y en base a los resultados de secuenciación de isoformas específicas de ApoE expresadas en las dos líneas celulares, los HUVSMC se expusieron durante 12 ha CC2238 / α ANP y ApoE2 recombinante o proteína ApoE3 (10 μ g / ml; Sigma). Las CAMSC se expusieron a CC2238 / α ANP y a la proteína ApoE3 o ApoE4 recombinante (10 μ g / ml; Sigma). Se agregaron proteínas recombinantes para ApoE a las VSMC como se describió previamente. 37

Veinticuatro horas después de la finalización de la exposición a CC2238 / α ANP y la isoforma ApoE recombinante específica, se realizó el recuento de células apoptóticas mediante análisis de citometría de flujo (FACS) y se extrajeron las proteínas totales para el análisis de transferencia Western de Nf- κ Bp65 y Smad4.

Los experimentos se realizaron por triplicado para cada isoforma ApoE.

Cultivo de células

Los HUVSMC disponibles en el mercado, adquiridos de ATCC (American Type Culture Collection; Manassas, VA, EE. UU.), Se cultivaron en medio Kaighn's F12 que contiene 1 mM de glutamina, 1, 5 g / l de bicarbonato de sodio, y suplementado con 0, 1 mg / ml de heparina, 0, 03 mg / ml de suplemento de crecimiento de células endoteliales, 10% de suero fetal bovino. Los CASMC disponibles comercialmente (adquiridos de Lonza, Walkersville, MD, EE. UU.) Se cultivaron en Smooth Muscle Growth Medium-2 (SmgM-2; Lonza). Se utilizaron cuatro lotes para cada línea celular para realizar todos los experimentos.

Las células se usaron dentro del quinto paso y al 70% de confluencia. Para la estimulación con TT2238 o CC2238 / α ANP, se sembraron en placas de 24 pocillos (8 x 10 4 células / pocillo), se cultivaron en su medio de crecimiento respectivo durante 24 h, posteriormente se privaron de hambre y se estimularon con α ANP a una concentración final. de 10 9 mol / l durante 12 h en presencia de suero de ternera fetal al 10%. Las placas de control recibieron medio libre de α ANP.

Extracción total de ARN

El ARN total se obtuvo con el reactivo Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, EE. UU.), Se sometió a tratamiento con ADNsa I (Qiagen, Venlo, Países Bajos) y posteriormente se purificó usando el Mini Kit RNeasy (Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La integridad del ARN se evaluó mediante electroforesis en gel de agarosa desnaturalizante y su concentración se verificó utilizando el espectrofotómetro NanoDrop2000c UV-Vis (Thermo Scientific, Waltham, MA EE. UU.).

Análisis de macroarrays RT-PCR

Se llevaron a cabo tres experimentos con cada estímulo y se combinó ARN para el análisis de macroarrays. Se usaron dos microgramos de ARN total para la síntesis de ADNc usando el kit RT 2 First Strand (Qiagen). Llevamos a cabo un análisis cuantitativo de macroarrays de RT-PCR utilizando una matriz de PCR de perfil de RT2 de aterosclerosis humana comprada a Qiagen. Los experimentos se realizaron como se describió anteriormente. 9 Brevemente, la plantilla de ADNc se mezcló con una de la mezcla maestra de PCR en tiempo real RTBR SY2 Green RT2 lista para usar (Qiagen). La matriz elegida contiene un panel de 84 juegos de cebadores para genes centrados en la vía (aterosclerosis humana), cinco genes de mantenimiento y tres controles de calidad de ARN y PCR. La mezcla se dividió en alícuotas en cada pocillo de la misma placa que contenía conjuntos de cebadores específicos de genes predispensados ​​y la PCR se realizó en el sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 (Life Technologies). Los experimentos se realizaron por triplicado. El análisis de los datos se llevó a cabo utilizando el portal web PCR Array Data Analysis (//www.superarray.-com/pcrarraydataanalysis.php) y el método ΔΔCt. 38 Los resultados se expresaron como niveles relativos de cada gen ARNm bajo el efecto de CC2238 o TT2238 / α ANP referido a la expresión de este gen en células no estimuladas (que se eligieron para representar la expresión 1x de cada gen). Los resultados se consideraron significativos cuando la expresión de ARNm fue 5 veces mayor o menor que la de las células no estimuladas.

RT-PCR cuantitativa de ApoE, NPR-C, Egr-1 (metodología SYBR Green)

Se mezclaron dos microlitros de ADNc con 5 μ l de SYBR Green PCR master Mix (Life Technologies) y 0, 5 μ l de cebadores específicos: ApoE (5′-GAGCAAGCGGTGGAGACAG-3 'y 5'-CATCAGCGCCCTCAGTTCC-3' reverso); NPR-C (5'-GGAAGACATCGTGCGCAATA-3 'hacia adelante y 5'-GATGCTCCGGATGGTGTCA-3' hacia atrás); Egr-1 (avance 5′-ACCGCAGAGTCTTTTCCTGACA-3 'y reversa 5′-GGTGCAGGCTCCAGGGAAAA-3').

Se usó β- actina como gen de mantenimiento (5'-GCAAGAGATGGCCACGGCTG-3 'hacia adelante y 5'-CCACAGGACTCCATGCCCAG-3' hacia atrás). La RT-PCR se llevó a cabo en el sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 con condiciones de ciclado de 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min seguido de 95 ° C durante 15 sy 60 ° C durante 60 s para un total de 40 ciclos. Las mediciones se realizaron por triplicado en cada ensayo. Los resultados se expresaron como niveles relativos de cada gen ARNm en comparación con las células de control.

RT-PCR cuantitativa de miRNA199a-3p, miRNA199a-5p, DNAJA4 (metodología TaqMan)

El ARN total se purificó para aislar ARN pequeños con un kit específico (miRNeasy Mini Kit; Qiagen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para la síntesis de ADNc de miR199a-3p, miR199a-5p y miRU87 de control, se mezcló 1 μg de ARN purificado con 3 μl de kit de síntesis de ADNc miodeno NCode VILO (Life Technologies) y 1 × RT-primer (Life Technologies) en un volumen de reacción total de 20 μ l. La reacción se incubó a 16 ° C durante 30 min, 42 ° C durante 30 min y 85 ° C durante 5 min en un termociclador T-100 (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). Luego, se agregaron 2 μl de la reacción RT a 1 μl de un ensayo de microARN TaqMan específico 20 × (miR199a-3p, miR199a-5p, miRU87; Life Technologies) y 10 μl de TaqMan Universal PCR Master Mix II con UNG (Life Technologies) en un volumen final de 20 μ l. La RT-PCR se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 con condiciones de ciclado de 95 ° C durante 10 minutos seguido de 95 ° C durante 15 sy 60 ° C durante 60 s durante un total de 40 ciclos. Cada ensayo TaqMan se realizó por triplicado. Los resultados se expresaron como niveles relativos de cada miRNA bajo el efecto de diferentes tratamientos en relación con las células no estimuladas.

Para la RT-PCR de DNAJA4, se mezclaron 2 μl de ADNc con 10 μl de TaqMan Universal Master Mix II con UNG y 1 μl de DNAJA4 TaqMan Gen Expression Assay (Life Technologies) en un volumen final de 20 μl. La β- actina se utilizó como gen de mantenimiento. La RT-PCR se realizó utilizando el sistema de PCR en tiempo real ViiA 7 con condiciones de ciclado de 50 ° C durante 2 min, 95 ° C durante 10 min seguido de 95 ° C durante 15 sy 60 ° C durante 60 s para un total de 40 ciclos Cada ensayo se realizó por triplicado. Los resultados se expresaron como niveles de ARNm bajo el efecto de diferentes tratamientos en relación con las células no estimuladas.

Extracción total de proteínas y transferencia Western

Las proteínas totales se extrajeron de las células 24 h después de la finalización de la exposición a TT2238 / α ANP o CC2238 / α ANP. Las muestras se lisaron en 1:10 peso / volumen en tampón de lisis (NaCl 50 mM, Tris-HCl 100 mM pH 7, 4, ácido etilendiaminotetracético (EDTA) 1 mM, SDS al 1%) suplementado con proteasa e inhibidores de la fosfatasa (Sigma Aldrich, Saint Louis, MO, EE. UU.), Incubados en hielo durante 15 min. y se centrifuga a 13 000 rpm durante 15 min. La concentración de proteínas se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas DC (Bio-Rad) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los lisados ​​de proteínas se hirvieron a 95 ° C durante 5 minutos en presencia de tampón de carga de gel (Bio-Rad). Cincuenta microgramos de cada muestra se cargaron en gel de SDS-poliacrilamida al 10% y se ejecutaron durante 120 minutos a 100 V. Las proteínas se transfirieron luego a membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF; Bio-Rad) usando el sistema de transferencia Turbo Trans-Blot (Bio-Rad ) Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon a temperatura ambiente durante 1 h en albúmina de suero bovino al 5% en tampón salino tamponado con Tris con Tween 20 al 0, 1% (Sigma) (TBS-T). Membranes were incubated at 4 °C overnight with the following primary antibodies:

anti-ApoE (1 : 1000; Millipore, Temecula, CA, USA), anti-Egr-1 (1 : 1000; Cell Signaling, Danvers, MA, USA), anti-phosphoJNK (1 : 200; Santa Cruz Laboratories, Santa Cruz, CA, USA), anti-JNK (1 : 200; Santa Cruz), anti-phospho-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-p38MAPK (1 : 200; Santa Cruz), anti-NF κ Bp65 (1 : 200; Santa Cruz), anti-cleaved caspase-3 (1 : 1000; Cell Signaling), anti-Smad4 (1:1000; Cell Signaling); anti-CREG (1:1000; R&D System, Minneapolis, MN, USA), anti- β -actin (1 : 1000; Santa Cruz).

Following three washes of 10 min in TBS-T, membranes were incubated for 1 h at room temperature with 1 : 5000 horseradish peroxidase-conjugated donkey anti-goat (for ApoE) or goat anti-mouse or goat anti-rabbit secondary antibodies diluted in TBS-T. After three washes of 10 min in TBS-T, signals were revealed with an enhanced chemiluminescence detection system (Luminata Crescendo; Millipore, Darmstadt, Germany) and the immunoreactivity of bands was visualized using ChemiDoc XRS+Imaging System (Bio-Rad). Protein bands were scanned and quantified densitometrically. They were finally normalized using β-actin levels.

NPR-C and Egr-1 gene silencing

NPR-C and Egr-1 gene silencing was performed with specific siRNAs (Mission siRNA; Sigma) by following conditions previously described. 10, 11 Twenty-four hours after transfection, both silenced and not silenced cells were exposed to CC2238/ α ANP for 12 h and subsequently extracted for total RNA and total proteins. Efficiency of gene silencing was assessed by RT-PCR, following conditions described above.

Role of oxidative stress in the Egr-1 induced increase by CC2238/ α ANP

The known role of oxidative stress on Egr-1 stimulation 17 was verified by exposing VSMCs to CC2238/ α ANP both in the absence and in the presence of apocynin, following conditions previously described. 9 Egr-1 expression levels were therefore assessed by western blotting.

Sequencing of apoE gene expressed in HUVSMCs and CASMCs

Genomic DNA was isolated from both HUVSMCs and CASMCs using a commercially available kit (Qiagen, Chicago, IL, USA). In order to identify the three allelic forms of human ApoE gene (allele ɛ2, ɛ3, ɛ4) PCR reactions were set up by using a specific pair of primers: forward 5′-CTCCCACTGTGCGACACC-3′, reverse 5′-CTGCTCCTTCACCTCGTCC-3′. DNA was first amplified by PCR with 40 cycles at an annealing temperature of 55 °C using a T-100 Thermal Cycler (Bio-Rad). Following purification of the PCR product (562 bp) with MinElute PCR purification kit (Qiagen), sequence reactions were prepared using the Big Dye Terminator v3.1 cycle sequencing Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA). Unincorporated dye terminators from sequencing reactions were removed using DyeEx 2.0 Spin kit (Qiagen). Purified fragments were electrophoresed on an ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) according to the manufacturer's protocol. All sequencing results were compared with those present in the NCBI databases using BLAST to confirm the allelic variants.

Flow-cytometry analysis

Twenty-four hours after completion of exposure to CC2238/ α ANP and the specific recombinant ApoE isoform, counting of apoptotic cells was performed by FACS using Annexin V-Fitc and propidium iodide (PI) staining (ImmunoStep, Salamanca, Spain). For this purpose, cells were harvested by incubation with 1 ml of trypsin/EDTA (Lonza) for 3 min at 37 °C. Trypsinization was stopped by addition of medium and the suspension was centrifuged at 1200 rpm for 5 min at 4 °C. Each pellet was washed with cold phosphate-buffered saline (PBS 1 × ). Then, tubes were vortexed thoroughly and centrifuged again as before. Cells were gently resuspended and vortexed in binding buffer at a concentration of 3 × 10 6 cells/ml. Then, 100 μ l of cell suspension was added to 5 μ l of Annexin V and 10 μ l of PI. Samples were mixed for 15 min in the dark at 4 °C and 400 μ l of PBS 1x was added to the solution. Ten thousand cells were analyzed by FACS on a BD Accuri C6 flow cytometer (Biosciences, Erembodegem-Dorp, Belgium) to count apoptotic cells. Both negative control (untreated cells) and positive control (cells treated with hydrogen peroxide) were included in the analysis.

análisis estadístico

Continuous variables are expressed as mean±SD Comparisons between two groups were performed using Student's t- test. When the analysis was adjusted for the multiplicity of compared groups, one-way ANOVA followed by Bonferroni post hoc test was performed. Normality of variables distribution was tested by the Kolmogorov–Smirnov test. GraphPad Software (San Diego, CA, USA; version 5.0) and SPSS statistical software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA; version 12.0) were used for statistical analysis. P <0, 05 se consideró significativo.

Información suplementaria

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Glosario

Akt

protein kinase B

ApoE

apolipoproteína E

ANP

atrial natriuretic peptide

TT2238/ α ANP

wild-type atrial natriuretic peptide at pos. 2238

CC2238/ α ANP

mutant atrial natriuretic peptide at pos. 2238

acampar

monofosfato de adenosina cíclico

CREG

cellular repressor of E1A-stimulated gene

CREB

cAMP responsive element binding protein

DNAJA4

DnaJ (Hsp40) homolog

Egr-1

early growth response protein-1

eNOS

óxido nítrico sintetasa endotelial

EDTA

ethylenediaminetetracetic acid

FOXO4

forkhead box O4

FACS

análisis de citometría de flujo

JNK

c-jun quinasa N-terminal

miRNA

microARN

NADPH

nicotinamida adenina dinucleótido fosfato-oxidasa

Nf- κB

nuclear factor kappa-light chain-enhancer of activated B cells

NPR-C

type C natriuretic peptide receptor

NPR-A

type A natriuretic peptide receptor

PKA

proteína quinasa A

ROS

especies de oxígeno reactivas

RT-PCR

real time-polymerase chain reaction

Smad4

mothers against decapentaplegic Homolog 4

TGF

tumor growth factor

VSMC

célula vascular del músculo liso

HUVSMC

human umbilical vein smooth muscle cell

CASMC

coronary artery smooth muscle cell

La información complementaria acompaña este documento en el sitio web de Muerte y enfermedad celular (//www.nature.com/cddis)