Señalización de insulina intestinal codifica dos mecanismos moleculares diferentes para la longevidad acortada inducida por el óxido de grafeno en caenorhabditis elegans | informes cientificos

Señalización de insulina intestinal codifica dos mecanismos moleculares diferentes para la longevidad acortada inducida por el óxido de grafeno en caenorhabditis elegans | informes cientificos

Anonim

Asignaturas

  • Ecotoxicologia
  • Toxicología médica

Resumen

Se ha demostrado que el óxido de grafeno (GO) causa múltiples toxicidades en varios organismos. Sin embargo, los mecanismos moleculares subyacentes para la longevidad acortada inducida por GO aún no están claros. Empleamos Caenorhabditis elegans para investigar la posible implicación de la vía de señalización de insulina en el control de la toxicidad GO y sus mecanismos moleculares subyacentes. La mutación del gen daf-2, age-1, akt-1 o akt-2 indujo una propiedad resistente de los nematodos a la toxicidad GO, mientras que la mutación del gen daf-16 condujo a una propiedad susceptible de los nematodos a la toxicidad GO, lo que sugiere que GO puede desregular las funciones del receptor DAF-2 / IGF-1, la cascada de quinasa mediada por AGE-1, AKT-1 y AKT-2 y el factor de transcripción DAF-16 / FOXO. El análisis de interacción genética sugirió la participación de la cascada de señalización de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 en el control de la toxicidad GO en la longevidad. Además, el análisis de interferencia de ARN intestinal (ARNi) demostró que GO redujo la longevidad al afectar las funciones de señalización en cascada de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 en el intestino. DAF-16 también podría regular la toxicidad de GO en la longevidad al funcionar aguas arriba de SOD-3, que codifica un sistema de antioxidación que evita la acumulación de estrés oxidativo. Por lo tanto, la señalización de insulina intestinal puede codificar dos mecanismos moleculares diferentes responsables de la toxicidad de GO en la inducción de la longevidad acortada. Nuestros resultados destacan el papel clave de la vía de señalización de insulina en el control de la toxicidad de GO en organismos.

Introducción

Los nanomateriales de carbono son una familia de nanomateriales de ingeniería (ENM) importantes con muchas propiedades únicas y aplicaciones potenciales 1, 2 . El óxido de grafeno (GO) es un miembro de los ENM de carbono bidimensionales con una sola capa de átomos de carbono unidos con sp 2 . Debido a su estabilidad química, alto coeficiente de conducción térmica, anfipaticidad, gran área de superficie y facilidad de funcionalización, GO tiene un gran potencial para su uso en la administración de fármacos, bioimagen, ingeniería de tejidos y agentes de bioensayo 1, 2 .

Dada la promesa excepcional de las aplicaciones GO, se han realizado una serie de estudios centrados en la toxicidad GO 4 . Algunos estudios han sugerido la citotoxicidad y varios aspectos de los efectos adversos en los animales, como la toxicidad pulmonar y la inmunotoxicidad por exposición a GO 4, 5, 6, 7, 8 . Más recientemente, se han publicado algunos informes con el objetivo de dilucidar aún más los mecanismos moleculares de la toxicidad GO 9, 10, 11, 12 . Un estudio ha demostrado que la activación de la señalización del receptor tipo toll 4 (TLR4) y la posterior producción autocrina de TNF-α podría estar involucrada en el control de la toxicidad GO en los macrófagos 10 . Además, se han identificado ARNm desregulados, proteínas y microARN (miARN) en células HepG2 humanas expuestas a GO o células GLC-82 9, 11, 12 .

Caenorhabditis elegans es un modelo animal clásico que ofrece un sistema de ensayo para investigar los mecanismos toxicológicos in vivo de los tóxicos, incluidos los ENM 13 . C. elegans comparte propiedades conservadas para procesos fisiológicos básicos, respuesta al estrés y vías de señalización molecular con humanos 14 . Utilizando C. elegans , estudios previos han sugerido la toxicidad de GO en las funciones de órganos específicos primarios (como el intestino) y secundarios (como las neuronas y los órganos reproductivos) 15, 16, 17, 18 . Con respecto a los mecanismos celulares de la toxicidad GO, los datos publicados han sugerido que la toxicidad GO podría ser consecuencia de la biodisponibilidad, la inducción de especies reactivas de oxígeno (ROS), la permeabilidad intestinal mejorada, la respuesta inmune innata interrumpida y la duración prolongada del ciclo de defecación en los nematodos 16, 17, 19, 20 . Estudios anteriores también han implicado el papel crucial de la barrera biológica intestinal contra la toxicidad de GO en nematodos 17, 21 . También se ha informado que la inducción del estrés oxidativo podría desempeñar un papel clave en el mecanismo químico de la longevidad acortada inducida por GO en los nematodos expuestos 15 . Sin embargo, los mecanismos moleculares para la reducción de la longevidad inducida por la toxicidad GO todavía son en gran medida desconocidos.

La vía de señalización de insulina / factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) se ha implicado como un mecanismo molecular clave para el control de la longevidad en nematodos 22, 23 . También se ha demostrado que esta vía de señalización desempeña funciones clave en la regulación de otros procesos biológicos importantes, incluidos el almacenamiento de grasa, la inmunidad innata y la respuesta al estrés 24, 25, 26 . Además, hemos demostrado previamente que la señalización de insulina regula la toxicidad de las partículas de partículas relacionadas con el tráfico (PM 2.5 ) en C. elegans 26 . En C. elegans , los ligandos de insulina se unen al receptor DAF-2 / IGF-1 (InR), activan la actividad de la tirosina quinasa e inician la cascada de varias quinasas: AGE-1 / fosfatidilinositol 3-quinasa (PI3K), PDK-1 / Quinasa 1 dependiente de 3-fosfoinositida, AKT-1/2 / serina / treonina quinasa Akt / PKB y SGK-1 / serina o treonina-proteína quinasa 23 . AKT y SGK-1 fosforilan e inactivan aún más el factor de transcripción DAF-16 / FOXO, bloqueando así la transcripción de genes diana como el gen sod-3 23, 27, 28, 29, 30 . DAF-18 / fosfatidilinositol 3, 4, 5-trifosfato 3-fosfatasa (PTEN) desfosforila AGE-1, que previene la fosforilación de DAF-16 por las quinasas aguas abajo 23, 27, 29 . El ensayo de actividad específica de tejido ha demostrado las importantes funciones de DAF-16 en la regulación de la longevidad en el intestino y las neuronas de los nematodos 30 . Curiosamente, nuestro estudio anterior ha sugerido que la mutación del gen sod-3 resultó en una propiedad susceptible de los nematodos a la toxicidad GO en la vida útil, la reproducción y el comportamiento de locomoción, e indujo una inducción más severa de la producción de ROS en nematodos expuestos a GO 19, 21 . En el presente estudio, empleamos un sistema de ensayo in vivo de C. elegans para investigar la posible participación de la vía de señalización de insulina en el control de la toxicidad de GO y sus posibles mecanismos moleculares. Nuestros resultados sugieren que la vía de señalización de insulina puede codificar dos mecanismos moleculares diferentes para la vida útil más corta inducida por GO en nematodos. El examen de estos mecanismos moleculares de la regulación de la toxicidad de GO por la vía de señalización de insulina proporciona una base importante para una mayor aclaración de las redes moleculares involucradas en el control de la toxicidad de GO en los organismos.

Resultados

Propiedades fisicoquímicas de GO

La distribución de tamaños de GO en el medio K se muestra en la Fig. S1a. La mayoría de los GO en el medio K estaban en el rango de 40-50 nm (Fig. S1a). El tamaño de agregación de GO fue de 386 ± 75 nm (Fig. S1a). GO apareció en forma de lámina, con un espesor de aproximadamente 1.0 nm en altura topográfica, que corresponde a aproximadamente una capa (Fig. S1b). El potencial Zeta del GO (100 mg / L) en medio K fue -22.5 ± 1.7 mV. La medición de espectroscopía Raman demostró una señal de banda D de GO después del tratamiento con ácido sulfúrico y KMnO 4, lo que indica una introducción de trastorno en la capa de grafito (Fig. S1c). Se encontraron una banda AG y una banda D a 1589 cm −1 y a 1336 cm −1, respectivamente (Fig. S1c).

La exposición a GO influyó en los patrones de expresión de genes que codifican la vía de señalización de insulina en nematodos

Entre los genes que codifican la vía de señalización de insulina en C. elegans , la exposición a GO (100 mg / L) dio como resultado un aumento significativo en los niveles de expresión de los genes daf-2, age-1, akt-1 y akt-2 , y una disminución en los niveles de expresión de los genes daf-18 y daf-16 en nematodos de tipo salvaje (Fig. 1a). Además, considerando el hecho de que la vía de señalización de insulina puede regular algunos procesos biológicos, como la longevidad, limitando la localización nuclear DAF-16 29, postulamos que la exposición a GO también podría afectar la localización nuclear DAF-16 en nematodos. Con la ayuda de la cepa transgénica de zIs356, observamos un aumento significativo en la expresión de DAF-16: GFP en los núcleos de nematodos expuestos a GO (100 mg / L) en comparación con el control (Fig. 1b). Por lo tanto, la exposición a GO no solo puede afectar las actividades transcripcionales de los genes que codifican la vía de señalización de la insulina, sino que también influye en la translocación núcleo-citoplasma de DAF-16 en nematodos.

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( a ) La exposición a GO alteró los niveles de expresión de algunos genes que codifican la ruta de señalización de insulina en nematodos de tipo salvaje. ( b ) La exposición a GO influyó en la translocación del núcleo de DAF-16 :: GFP. Las puntas de flecha indican la expresión de DAF-16 en el intestino. La concentración de exposición a GO fue de 100 mg / L. Se realizó una exposición prolongada de larvas L1 a adultos jóvenes. Las barras representan medias ± SEM. ** P <0.01 vs. control.

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La mutación del gen daf-16 indujo una propiedad susceptible de los nematodos a la toxicidad GO

En C. elegans , el gen daf-16 codifica un factor de transcripción FOXO, que regula varios procesos biológicos al afectar las funciones de sus genes objetivo 23 . Estudios previos han implicado que el comportamiento de locomoción es un punto final muy sensible para evaluar los efectos adversos de los ENM en nematodos 31, 32 . El comportamiento de locomoción fue evaluado por el golpe de cabeza y la flexión del cuerpo en nematodos 31, 32 . Después de una exposición prolongada, encontramos que la mutación por pérdida de función del gen daf-16 resultó en una disminución más severa en el golpe de cabeza o la flexión del cuerpo en los nematodos expuestos a GO en comparación con los nematodos de tipo salvaje expuestos a GO (Fig. 2a). Usando la esperanza de vida como punto final, observamos además que los mutantes daf-16 ( mu86 ) expuestos a GO mostraron una vida útil más severamente reducida en comparación con los nematodos de tipo salvaje expuestos a GO (Fig. 2b, Tabla S1). Estos resultados sugieren que la mutación del gen daf-16 induce una mayor susceptibilidad a la toxicidad GO en C. elegans .

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( a ) Efectos de la mutación del gen daf-16 o daf-2 sobre el comportamiento de locomoción en nematodos expuestos a GO. ( b ) Efectos de la mutación del gen daf-16 o daf-2 en la vida útil de los nematodos expuestos a GO. ( c ) Las mutaciones del gen age-1, akt-1, akt-2 o daf-18 afectaron la toxicidad de GO en el comportamiento de locomoción en nematodos. ( d ) Las mutaciones del gen age-1, akt-1, akt-2 o daf-18 afectaron la toxicidad de GO en la vida útil de los nematodos. El comportamiento de locomoción de los nematodos se evaluó mediante los puntos finales del golpe de cabeza y la flexión del cuerpo. La concentración de exposición a GO fue de 100 mg / L. Se realizó una exposición prolongada de larvas L1 a adultos jóvenes. Las barras representan medias ± SEM. ** P <0.01 vs. control (si no está especialmente indicado).

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La mutación del gen daf-2 indujo una propiedad resistente de los nematodos a la toxicidad GO

En C. elegans , el gen daf-2 codifica un receptor de insulina, que es responsable de recibir señales de los péptidos de insulina 23 . Utilizando el comportamiento de locomoción como punto final, encontramos que los mutantes daf-2 ( e1370 ) eran resistentes a la toxicidad GO tanto en el golpe de cabeza como en la curvatura del cuerpo en comparación con los nematodos de tipo salvaje expuestos a GO (Fig. 2a). Además, los mutantes daf-2 ( e1370 ) expuestos a GO exhibieron una vida útil significativamente mayor en comparación con los nematodos de tipo salvaje expuestos a GO (Fig. 2b, Tabla S1). Por lo tanto, nuestros resultados sugieren que la mutación daf-2 ( e1370 ) induce resistencia a la toxicidad GO.

Los genes age-1, akt-1, akt-2 o daf-18 estuvieron involucrados en el control de la toxicidad de GO en nematodos

En C. elegans , los genes age-1, akt-1 y akt-2 codifican la cascada de quinasas entre el DAF-2 y el DAF-16, y el DAF-18 actúa como un supresor del AGE-1 en la insulina. vía de señalización 23 . Utilizando el comportamiento de locomoción y la esperanza de vida como puntos finales, encontramos que los mutantes age-1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ) y akt-2 ( ok393 ) eran resistentes a la toxicidad GO en el comportamiento de locomoción o esperanza de vida (Fig. 2c, d, Tabla S2). En contraste, los mutantes daf-18 ( ok480 ) fueron susceptibles a la toxicidad de GO en el comportamiento de locomoción o la esperanza de vida (Fig. 2c, d, Tabla S2). Estos resultados sugieren que AGE-1, AKT-1 y AKT-2 constituyen una cascada de quinasas para la vía de señalización de insulina, que está involucrada en el control de la toxicidad de GO en nematodos.

Interacciones genéticas de genes en la vía de señalización de insulina en la regulación de la toxicidad de GO en la longevidad en nematodos

Luego investigamos las interacciones genéticas del gen daf-16 con otros genes en la vía de señalización de insulina para regular la toxicidad de GO en la longevidad de los nematodos. Descubrimos que la mutación del gen daf-16 podría reducir efectivamente la vida útil de los mutantes daf-2 ( e1370 ), edad-1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ) o akt-2 ( ok393 ) expuestos a GO (Fig. . 3, Tabla S3). Estos resultados implican que DAF-16 puede actuar aguas abajo de DAF-2, AGE-1, AKT-1 y AKT-2 para regular la toxicidad de GO en la longevidad de los nematodos.

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La concentración de exposición a GO fue de 100 mg / L. Se realizó una exposición prolongada de larvas L1 a adultos jóvenes.

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Descubrimos además que la mutación del gen daf-18 podría reducir efectivamente la esperanza de vida en mutantes de la edad expuesta a GO ( hx546 ) (Fig. 3, Tabla S3), lo que confirma el papel supresor de DAF-18 en AGE-1 en el control de toxicidad GO en nematodos.

Actividad específica de tejido de DAF-16 en la regulación de la toxicidad GO en nematodos

En C. elegans , el gen daf-16 se expresa en casi todos los tejidos, incluidos el intestino, las neuronas, los músculos y la faringe 23 . Usando el comportamiento de locomoción y la esperanza de vida como puntos finales, encontramos que la expresión del gen daf-16 en las neuronas, los músculos o la faringe no influyó significativamente en el comportamiento de locomoción o la vida útil en los mutantes daf-16 ( mu86 ) expuestos a GO (Fig. 4, Tabla S4). En contraste, observamos que la expresión del gen daf-16 en el intestino aumentó efectivamente el comportamiento de locomoción disminuido o la vida útil reducida en los mutantes daf-16 ( mu96 ) expuestos a GO (Fig. 4, Tabla S4). Estos resultados sugieren que el gen daf-16 puede actuar principalmente en el intestino para regular la toxicidad de GO en los nematodos.

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( a ) Actividad específica de tejido de DAF-16 en la regulación de la toxicidad de GO en el comportamiento de locomoción en nematodos. El comportamiento de locomoción de los nematodos se evaluó mediante los puntos finales del golpe de cabeza y la flexión del cuerpo. ( b ) Actividad específica del tejido de DAF-16 en la regulación de la toxicidad de GO en la vida útil de los nematodos. La concentración de exposición a GO fue de 100 mg / L. Se realizó una exposición prolongada de larvas L1 a adultos jóvenes. Las barras representan medias ± SEM. ** P <0.01 vs. tipo salvaje.

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La interferencia de ARN específica del intestino (RNAi) de los genes que codifican la vía de señalización de la insulina afectó la toxicidad de GO en la longevidad de los nematodos

Para examinar más a fondo la actividad específica de tejido de otros genes en la vía de señalización de insulina en la regulación de la toxicidad de GO, realizamos RNAi específico de intestino en la cepa VP303 33 . En los nematodos, encontramos que el RNAi específico del intestino del gen daf-2, age-1, akt-1 o akt-2 resultó en una vida útil prolongada, mientras que el RNAi específico del intestino del gen daf-16 o daf-18 condujo a vida útil reducida (Fig. 5, Tabla S5). Además, después de una exposición prolongada, se observó una propiedad resistente a la toxicidad GO en nematodos con el RNAi específico del intestino del gen daf-2, age-1, akt-1 o akt-2 , mientras que una propiedad susceptible a la toxicidad GO fue observado en nematodos sometidos a RNAi específico del intestino del gen daf-16 o daf-18 (Fig. 5, Tabla S5). Estos resultados sugieren que la vía de señalización de la insulina puede actuar en el intestino para regular la toxicidad de GO en los nematodos. Dado que la cepa VP303 exhibe déficits en el comportamiento de locomoción, no examinamos los efectos del ARNi específico del intestino de los genes que codifican la vía de señalización de insulina sobre el comportamiento de locomoción en nematodos expuestos a GO.

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La concentración de exposición a GO fue de 100 mg / L. Se realizó una exposición prolongada de larvas L1 a adultos jóvenes.

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Regulación de la toxicidad GO por el objetivo DAF-16 SOD-3

En C. elegans, el sod-3 es un gen diana importante del gen daf-16 , y codifica una superóxido dismutasa de hierro / manganeso mitocondrial necesaria para defenderse contra el estrés oxidativo 23 . La SOD-3 se expresa en la faringe en la cabeza, el intestino, el músculo, la vulva y la cola 34 . En general, se espera una expresión débil de SOD-3 en el intestino 34 . Sin embargo, después de una exposición prolongada, observamos que GO podría aumentar significativamente la expresión de SOD-3 en el intestino de los nematodos en comparación con la de control (Fig. 6a).

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( a ) Efectos de la exposición a GO en la expresión de SOD-3 :: GFP. La izquierda muestra imágenes para la expresión de SOD-3 :: GFP, y la derecha muestra la comparación de la fluorescencia relativa del intestino de SOD-3 :: GFP en el intestino de los nematodos. Los asteriscos indican el intestino de los nematodos. ( b ) Efectos del ARNi específico del intestino del gen sod-3 en la vida útil de los nematodos expuestos a GO. ( c ) Efectos de la sobreexpresión intestinal del gen daf-16 sobre la toxicidad de GO en la vida útil de los nematodos. ( d ) Efectos de la mutación sod-3 sobre la esperanza de vida en nematodos expuestos a GO que sobreexpresan el gen daf-16 en el intestino en nematodos. La concentración de exposición a GO fue de 100 mg / L. Se realizó una exposición prolongada de larvas L1 a adultos jóvenes. Las barras representan medias ± SEM. ** P <0.01 vs. tipo salvaje.

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Usando VP303 como la herramienta de ARNi intestinal, encontramos que el ARNi intestinal del gen sod-3 indujo una propiedad susceptible de los nematodos a la toxicidad GO en la longevidad de los nematodos (Fig. 6b, Tabla S6). Sin embargo, el ARNi intestinal del gen sod-3 no afectó la vida útil de los nematodos en ausencia de exposición a GO (Fig. 6b, Tabla S6). Por lo tanto, SOD-3 también puede actuar en el intestino para regular la toxicidad de GO en la longevidad de los nematodos.

Interacción genética entre DAF-16 y SOD-3 en la regulación de la toxicidad de GO en la longevidad en nematodos

Para examinar más a fondo la interacción entre el gen daf-16 y el gen sod-3 en la regulación de la toxicidad GO, construimos la cepa transgénica de Ex ( Pges-1-daf-16 ), en la que el gen daf-16 se sobreexpresó en el intestino de nematodos. La sobreexpresión intestinal del gen daf-16 indujo una propiedad resistente de los animales a la toxicidad GO en la longevidad (Fig. 6c, Tabla S7). Por el contrario, observamos que la propiedad resistente de la cepa transgénica de Ex ( Pges-1-daf-16 ) a la toxicidad GO en la longevidad podría inhibirse notablemente por la mutación sod-3 en nematodos (Fig. 6d, Tabla S7). En condiciones normales, el mutante sod-2 ( gk235 ) tuvo una vida útil similar a la del N2 de tipo salvaje, mientras que la mutación del gen sod-2 obviamente no afectó el fenotipo de nematodos de larga vida que sobreexpresa el gen daf-16 en el intestino (Fig. S2, Tabla S7). Estos resultados sugieren que DAF-16 puede funcionar aún más arriba de SOD-3 para regular la toxicidad de GO en la longevidad de los nematodos.

Interacción genética entre DAF-16 y SOD-3 en la regulación de la toxicidad de GO al inducir la producción de ROS

Finalmente, investigamos la interacción entre DAF-16 y SOD-3 en la regulación de la toxicidad de GO al inducir la producción de ROS intestinal en nematodos. La mutación del gen sod-3 o la sobreexpresión del gen daf-16 en el intestino no indujeron una producción de ROS significativa en los nematodos en ausencia de exposición a GO (Fig. S3). Sin embargo, después de la exposición a GO, observamos que la sobreexpresión del gen daf-16 en el intestino suprimió significativamente la inducción de la producción de ROS intestinal en los nematodos (Fig. S3). Por el contrario, después de la exposición a GO, la mutación del gen sod-3 fortaleció la inducción de la producción de ROS intestinal en los nematodos (Fig. S3). Además, después de la exposición a GO, la mutación del gen sod-3 indujo aún más la inducción significativa de la producción de ROS intestinal en nematodos que sobreexpresan el gen daf-16 en el intestino (Fig. S3).

Discusión

Estudios anteriores han sugerido que la vía de señalización de la insulina está involucrada en el control de procesos biológicos como la inmunidad innata y la respuesta al estrés en nematodos 25, 26 . En el presente estudio, proporcionamos evidencia adicional para apoyar la participación de la vía de señalización de insulina en el control de la toxicidad de ENM específicos como GO. En los nematodos, la exposición a GO a una concentración de 100 mg / L aumentó los niveles de expresión de los genes daf-2, age-1, akt-1 y akt-2 , mientras que disminuyó los niveles de expresión de daf-18 y daf- 16 genes (Fig. 1a). Estos resultados implican que, al menos a la concentración examinada, la exposición a GO puede desregular las funciones del receptor DAF-2 / IGF-1, la cascada de quinasa mediada por AGE-1, AKT-1 y AKT-2 y DAF-16 / FOXO factor de transcripción (Fig. 7). Más interesante aún, también encontramos que GO es capaz de afectar la función de AGE-1 a través de la regulación negativa de la expresión de DAF-18 en nematodos (Fig. 7).

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La evidencia de los mutantes genéticos confirmó aún más el papel de DAF-2, AGE-1, AKT-1, AKT-2, DAF-18 y DAF-16 en la regulación de la toxicidad de GO. La mutación del gen daf-2, age-1, akt-1 o akt-2 indujo una propiedad resistente de los nematodos a la toxicidad GO; sin embargo, la mutación del gen daf-18 o daf-16 indujo una propiedad susceptible de los nematodos a la toxicidad GO (Fig. 2, Tabla S1 y S2). En C. elegans, se ha informado que los mutantes daf-2, age-1, akt-1 y akt-2 eran resistentes a la infección de Pseudomonas aeruginosa ; sin embargo, el mutante daf-18 o daf-16 infectado por P. aeruginosa mostró una vida útil similar a la de los nematodos de tipo salvaje infectados por P. aeruginosa 25 . Se ha informado además que PM 2.5 aumentó significativamente los niveles de expresión de los genes daf-2 y akt-1 , mientras que disminuyó los niveles de expresión de los genes daf-18 y daf-16 26 . Estos resultados implican que la vía de señalización de insulina puede regular diferentes procesos biológicos a través de diferentes cascadas de señalización en nematodos.

El análisis de interacción genética ha sugerido que la cascada de señalización básica de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 podría desempeñar un papel en el control de la toxicidad de GO en la longevidad de los nematodos (Figuras 3 y 7, Tabla S3) . También se ha demostrado que la cascada de señalización de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 está involucrada en el control de la respuesta inmune de los nematodos en el contexto de la infección por P. aeruginosa 25 . Estos resultados sugieren que DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 puede ser una cascada de señalización conservada para la vía de señalización de insulina en la regulación de eventos biológicos asociados con inmunidad innata, respuesta al estrés y nanotoxicidad en nematodos.

Estudios anteriores han sugerido que la expresión intestinal de DAF-16 explica en gran medida su función en la regulación de la longevidad en los nematodos 22, 23, 30 . Sin embargo, la actividad específica del tejido de DAF-16 en la regulación de la respuesta al estrés o la nanotoxicidad sigue sin estar clara. Además, un estudio previo ha demostrado que la señalización de la insulina está involucrada en el control de la toxicidad de PM 2.5 en el desarrollo y la función del intestino en los nematodos 26 . En este estudio, encontramos que la actividad específica del intestino de DAF-16 era necesaria para su función en la regulación de la toxicidad de GO en la longevidad de los nematodos (Fig. 4, Tabla S4). Curiosamente, observamos que el ARNi intestinal de los genes que codifican la cascada de señalización de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 también afectó la toxicidad de GO en la longevidad de los nematodos (Fig. 5, Tabla S5). Estos resultados implican que la exposición a GO puede reducir la longevidad al desregular las funciones de la cascada de señalización de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16, una cascada de señalización conservada requerida para el control de la longevidad, en el intestino de los nematodos 22 23 . En otras palabras, es probable que la señalización de la insulina intestinal esté involucrada en la regulación de la toxicidad de GO en la longevidad de los nematodos. Presumimos que la señalización de insulina alterada podría ser uno de los mecanismos moleculares de la toxicidad GO en la longevidad de los nematodos (Fig. 7).

En este estudio, encontramos que la señalización de la insulina podría contribuir potencialmente a otro mecanismo molecular para la toxicidad de GO en la longevidad. Nuestros resultados sugieren que el DAF-16 funcionó aguas arriba de SOD-3 para regular la toxicidad de GO en la longevidad (Fig. 6d, Tabla S7). En los nematodos, el gen sod-3 codifica el sistema de antioxidación contra la inducción del estrés oxidativo. En los nematodos expuestos a GO, la función de SOD-3 contra el estrés oxidativo se confirmó aún más por el ensayo de producción de ROS en mutante sod-3 (Fig. S3). Curiosamente, encontramos que la mutación del gen sod-3 podría inducir aún más la inducción significativa de la producción de ROS en los nematodos expuestos a GO que sobreexpresan el gen daf-16 en el intestino (Fig. S3). Estos resultados implican que la exposición a GO también puede reducir la longevidad al afectar las funciones del sistema de antioxidación contra la inducción del estrés oxidativo. Presumimos que este es otro mecanismo molecular para la toxicidad de GO en la longevidad, que depende de la señalización de la insulina y su importante gen diana sod-3 en los nematodos (Fig. 7). Este mecanismo propuesto también proporciona una base para el papel del estrés oxidativo en la inducción de toxicidad GO en nematodos como se describió anteriormente en otros informes 15 .

En C. elegans , el DAF-16 actúa como un factor de transcripción para activar la actividad de sus genes objetivo cuando DAF-16 se transloca en el núcleo 22, 23 . Curiosamente, observamos que, junto con la expresión severamente disminuida de DAF-16, se encontró que cierta cantidad de DAF-16 se translocaba al núcleo (Fig. 1b). Estos resultados implican que al menos una cierta cantidad de DAF-16 translocada al núcleo también puede inducir un circuito de retroalimentación positiva entre DAF-16 y otros componentes de la vía de señalización en nematodos.

En conclusión, investigamos la participación de la vía de señalización de la insulina en el control de la toxicidad de GO en la longevidad y los mecanismos subyacentes en los nematodos. Identificamos una cascada de señalización de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 en la vía de señalización de insulina que está involucrada en el control de la toxicidad de GO en la longevidad. Además, descubrimos que esta cascada de señalización actuaba principalmente en el intestino para regular la toxicidad de GO en la longevidad. Según nuestros resultados, planteamos la hipótesis de que uno de los mecanismos moleculares para la toxicidad de GO es que GO podría desregular la cascada de señalización de DAF-2-AGE-1-AKT-1/2-DAF-16 en la vía de señalización de insulina. Además, encontramos que la vía de señalización de insulina podría codificar otro mecanismo molecular para la longevidad reducida inducida por GO. La exposición a GO podría suprimir la función de DAF-16 dentro de la señalización de insulina y, por lo tanto, conducir a una mayor inhibición de la función de SOD-3, que desempeña un papel importante en la defensa contra el estrés oxidativo en los nematodos expuestos a GO. Los mecanismos moleculares codificados por señalización de insulina para la reducción de la longevidad inducida por GO resaltan el papel potencial de la vía de señalización de insulina en el control de la toxicidad de GO en organismos.

Métodos

Reactivos y preparación de GO

GO se preparó a partir del polvo de grafito natural utilizando un método de Hummer modificado 35, 36 . Se añadieron grafito (2 g) y nitrato de sodio (1 g) en un matraz de 250 ml. Después de la adición de H2SO4 concentrado (50 ml) en hielo, se añadió KMnO4 (7 g) a la mezcla. Y luego, se gotearon lentamente 90 ml de H2O en la pasta después de que la temperatura de la mezcla se calentó a 35ºC. Después de agitar la suspensión diluida a 70 ° C durante otros 15 minutos, la suspensión se trató con la mezcla de 7 ml de H2O2 al 30% y 55 ml de H2O. La suspensión caliente resultante se filtró para obtener un filtro amarillo-marrón. torta, que se lavó adicionalmente con una solución de HCl al 3%, seguido de secado a 40 ° C durante 24 h. GO se obtuvo por ultrasonidos de óxido de grafito tal como se hizo en agua durante 1 h.

GO se sonicó durante 30 minutos (40 kHz, 100 W) y se dispersó en medio K para preparar una solución madre (1 mg / L). La solución madre se diluyó a la concentración utilizada (100 mg / L) con medio K justo antes de la exposición. Un estudio anterior sugirió que GO a una concentración de 100 mg / L podría disminuir la vida útil de los nematodos 16 . Todos los demás productos químicos se obtuvieron de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).

Caracterización de GO

GO se caracterizó por microscopía electrónica de transmisión (TEM, JEM-200CX, JEOL, Japón), microscopía de fuerza atómica (AFM, SPM-9600, Shimadzu, Japón), espectroscopía Raman utilizando excitación de longitud de onda de 632 nm (espectrómetro Renmanw Invia Plus láser Raman, Renishaw, Reino Unido), y el potencial zeta analizado por Nano Zetasizer utilizando una técnica de dispersión de luz dinámica. Para realizar la medición de AFM, la suspensión de GO se pipeteó sobre sustratos de Si, y los sustratos de Si se secaron al aire y se colocaron debajo de la punta de AFM.

C. elegans preparación de cepas

Los nematodos se mantuvieron en placas de medio de crecimiento de nematodos (NGM) sembradas con Escherichia coli OP50 a 20 ° C como se describió anteriormente 37 . Los nematodos utilizados en el presente estudio fueron N2 de tipo salvaje, mutantes de daf-16 ( mu86 ), daf-2 ( e1370 ), edad-1 ( hx546 ), akt-1 ( ok525 ), akt-2 ( ok393 ), daf -18 ( ok480 ), sod-3 ( gk235 ), daf-16 ( mu86 ); sod-3 ( gk235 ) y daf-16- ( mu86 ); daf-2 ( e1370 ) y cepas transgénicas de VP303 / kbIs7 [ nhx-2p :: rde-1 ], zIs356 [P daf-16 :: daf-16a / b :: GFP ], daf-16 ( mu86 ) Ex (P ges-1-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P unc-14-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P myo-3-daf-16 ), daf-16 ( mu86 ) Ex (P myo-2-daf-16 ), Ex (P ges-1-daf-16 ) y Ex (P ges-1-daf-16 ); sod-3 ( gk235 ). Algunas de las cepas utilizadas se obtuvieron originalmente del Centro de Genética de Caenorhabditis (financiado por la Oficina de Programas de Infraestructura de Investigación de NIH (P40 OD010440)). Se lavaron los nematodos grávidos de las placas en tubos de centrífuga y se lisaron con una mezcla de blanqueo (NaOH 0, 45 M, HOCl al 2%). Se prepararon poblaciones síncronas de larvas de L1 según la edad descrita anteriormente 38 . La exposición prolongada a GO se realizó de larvas L1 a adultos jóvenes en placas de cultivo de tejidos estériles de 12 pocillos a 20 ° C en presencia de alimentos (OP50). Los nematodos expuestos se usaron para la evaluación de toxicidad utilizando la esperanza de vida, el comportamiento de locomoción y la producción de ROS como puntos finales.

Transcripción inversa y reacción en cadena cuantitativa en tiempo real de la polimerasa (qRT-PCR)

Los ARN totales se extrajeron con el kit RNeasy Mini (Qiagen) y luego se transcribieron inversamente con el kit de reactivos PrimeScript TM RT (Takara, Otsu, Shiga, Japón). Después de la síntesis de ADNc, se realizó una PCR en tiempo real utilizando SYBR Premix Ex Taq ™ (Takara) para la amplificación de productos de PCR. La PCR de transcripción inversa cuantitativa se realizó a la temperatura de recocido optimizada de 58 ° C. Se determinó la cuantificación relativa de los genes objetivo en comparación con el gen tba-1 de referencia que codifica una proteína tubulina. Los resultados finales se expresaron como la relación de expresión relativa entre el gen objetivo y el gen de referencia. Los cebadores diseñados para genes específicos y el gen tba-1 de referencia se muestran en la Tabla S8. Todas las reacciones se llevaron a cabo por triplicado.

DAF-16 ensayo de translocación nuclear

La translocación nuclear DAF-16 se puntuó después de la exposición de la cepa transgénica de zIs356 a GO. Intestinal DAF-16 :: GFP se calificó como localización nuclear en la parte anterior del cuerpo. Las imágenes se tomaron con un microscopio de fluorescencia Zeiss Imager A2. Se examinaron tres experimentos independientes con diez nematodos por tratamiento.

Evaluación de toxicidad

El ensayo de la vida útil se realizó a 20 ° C básicamente como se describe 39 . Los nematodos hermafroditas se transfirieron diariamente durante los primeros 4 días de la edad adulta. Después de eso, los nematodos se revisaron todos los días. Los nematodos se calificarían como muertos si no se movieran incluso después de repetidos golpes con un pico. Cuarenta nematodos fueron examinados por tratamiento, y se realizaron tres réplicas.

El comportamiento de locomoción de los nematodos se evaluó mediante los puntos finales del golpe de cabeza y la flexión del cuerpo como se describe 40 . Un golpe en la cabeza se definió como un cambio en la dirección de flexión en la mitad del cuerpo. Un doblez del cuerpo se contó como un cambio en la dirección de la parte de los nematodos correspondiente al bulbo posterior de la faringe a lo largo del eje y , suponiendo que el nematodo viajaba a lo largo del eje x . Se examinaron veinte nematodos por tratamiento y se realizaron diez réplicas.

El método para la producción de ROS se realizó como se describió anteriormente 41 . Después de la exposición, los nematodos se transfirieron a diacetato 1 μM de 5 ', 6′-clorometil-2', 7′-diclorodihidro-fluoresceína (CM-H2DCFDA; Sondas moleculares) en placas de cultivo de tejidos estériles de 12 pocillos para incubar durante 3 ha 20 h ° C en la oscuridad sin adición de alimentos. Los nematodos se montaron en almohadillas de agar al 2% para su examen a 488 nm de longitud de onda de excitación y 510 nm de filtro de emisión con un microscopio confocal de escaneo láser (Leica, TCS SP2, Bensheim, Alemania). La intensidad de fluorescencia relativa del intestino fue semicuantificada. Las ROS semicuantificadas se expresaron como unidades de fluorescencia relativa (RFU) y se normalizaron a la autofluorescencia. Se examinaron treinta nematodos por tratamiento y se realizaron cinco réplicas.

ARNi

El ARNi se realizó alimentando a los nematodos con E. coli cepa HT115 (DE3) que expresa ARN bicatenario que es homólogo a un gen diana como se describe 42 . E. coli HT115 (DE3) cultivado en caldo LB que contiene ampicilina (100 μg / ml) a 37 ° C durante la noche se colocó en placa sobre NGM que contiene ampicilina (100 μg / ml) e isopropil 1-tio-β-D-galactopiranosido (IPTG, 5 mM). Las larvas L2 se colocaron en placas de ARNi durante 2 días a 20 ° C hasta que los nematodos se volvieron grávidos. Los adultos grávidos se transfirieron a céspedes bacterianos frescos que expresaban ARNi para poner huevos durante 2 h para obtener la segunda generación de población de ARNi. Se permitió que los huevos se desarrollaran a 20 ° C para adultos jóvenes para los ensayos posteriores.

Construcciones de ADN y transformación de la línea germinal.

Para generar la secuencia promotora portadora del vector de entrada, se amplificaron las regiones promotoras para el gen ges-1 expresado especialmente en el intestino, el gen unc-14 expresado especialmente en las neuronas, el gen myo-3 expresado especialmente en el músculo y el gen myo-2 expresado especialmente en la faringe por PCR a partir de ADN genómico de C. elegans de tipo salvaje. Los fragmentos promotores se insertaron en el vector pPD95_77 en la orientación de sentido. El ADNc de daf-16 se amplificó por PCR, y se insertó en el vector de entrada correspondiente que portaba la secuencia promotora ges-1, unc-14, myo-3 o myo-2 . La transformación de la línea germinal se realizó como se describe al coinyectar el ADN de prueba a una concentración de 10–40 μg / ml y el ADN marcador de P lin-44 :: gfp o unc-119 (+) a una concentración de 60 μg / ml en el gónada de nematodos 43 .

análisis estadístico

Todos los datos en este artículo se expresaron como medias ± error estándar de la media (SEM). Los gráficos se generaron usando Microsoft Excel (Microsoft Corp., Redmond, WA). El análisis estadístico se realizó con SPSS 12.0 (SPSS Inc., Chicago, EE. UU.). Las diferencias entre los grupos se determinaron mediante análisis de varianza (ANOVA). Los niveles de probabilidad de 0.05 y 0.01 se consideraron estadísticamente significativos.

Información Adicional

Cómo citar este artículo : Zhao, Y. et al . La señalización de la insulina intestinal codifica dos mecanismos moleculares diferentes para la longevidad acortada inducida por el óxido de grafeno en Caenorhabditis elegans. Sci. Rep. 6, 24024; doi: 10.1038 / srep24024 (2016).

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